在探索人體復(fù)雜的免疫系統(tǒng)時(shí)，我們經(jīng)常與一類特殊細(xì)胞—中性粒細(xì)胞（Neutrophils）不期而遇。它們是血液中數(shù)量僅次于紅細(xì)胞的細(xì)胞類型，占據(jù)了成人白細(xì)胞總數(shù)的40-70%[1]。中性粒細(xì)胞的主要免疫功能包括吞噬、脫顆粒和形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)。此外，它們還分泌幾種調(diào)節(jié)炎癥的細(xì)胞因子和趨化因子[2]。然而，中性粒細(xì)胞在體外研究中卻充滿了挑戰(zhàn)，包括短至6-8小時(shí)的半衰期、對(duì)凋亡和激活的極度敏感性，以及難以擴(kuò)增和冷凍保存的特性。用密度梯度等傳統(tǒng)方法分離特定的中性粒細(xì)胞群體是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)檫@種方法會(huì)增加極化反應(yīng)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的人工激活[3,4]。
NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2 單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)，以其溫和、低激活的分選方式，確保了更好的存活率和純度，使得中性粒細(xì)胞的研究和應(yīng)用邁出了重要一步。
在室溫條件下采集全血并于兩小時(shí)內(nèi)處理，通過雙梯度離心法從全血中分離中性粒細(xì)胞。全血與緩沖液（HBSS、1% BSA以及2mM EDTA）1:1混合后，置于由Leuko Spin Medium和PBMC Spin Medium組成的雙梯度中，經(jīng)過1000 x g離心30分鐘，收集粒細(xì)胞層。再通過緩沖液洗滌和1X RBC Lysis Buffer裂解紅細(xì)胞，最后用分選緩沖液重懸細(xì)胞，使?jié)舛冗_(dá)到1.0 x 10^7 cell/mL
用Human TruStain FcX和True-Stain Monocyte Blocker阻斷非特異性結(jié)合，并在室溫下?lián)嵊?5分鐘，隨后用CD45 APC-Cy7、CD16 AF488、CD11b PE和SYTOX AADvanced對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。經(jīng)37 μm濾帽過濾后，以3 x 105 cell/mL的濃度進(jìn)行分析和分選。
感興趣的細(xì)胞群體由CD16-AF488陽性和SYTOX AADvanced陰性的活中性粒細(xì)胞組成(圖1)。將1 x 105個(gè)細(xì)胞分選到含有分選緩沖液的收集管中。此外，制備了一個(gè)樣本并用細(xì)胞活化混合物（BioLegend，#423301）進(jìn)行刺激，作為中性粒細(xì)胞活化的對(duì)照。而且，使用單染對(duì)照、SpectraComp 補(bǔ)償微球（Slingshot Bio，#SSB-05-A）和 ViaComp 微球（Slingshot Bio，#SSBS-003）創(chuàng)建了一個(gè)補(bǔ)償矩陣。使用WOLF G2軟件進(jìn)行細(xì)胞分選，通過一系列圈門策略，從單細(xì)胞門到存活細(xì)胞門，再到CD45陽性的白細(xì)胞門，最后確定CD16陽性的中性粒細(xì)胞。
圖1. 分選中性粒細(xì)胞的圈門策略：使用WOLF G2軟件，用戶可以輕松地對(duì)感興趣的群體進(jìn)行圈門以排序，(A)使用FSC/BSC散點(diǎn)圖創(chuàng)建樣本門并消除碎片。(B)通過FSC-width vs FSC-H圖確定了單細(xì)胞門。(C)用活性染料從單細(xì)胞門鑒定活細(xì)胞，(D)白細(xì)胞鑒定為CD45+，(E)最后，中性粒細(xì)胞在CD45+ vs CD16+圖中被鑒定為CD16+。
分選后的樣本在37°C、5% CO2環(huán)境中孵育2小時(shí)，然后重新使用WOLF G2進(jìn)行分析，評(píng)估存活率、純度和中性粒細(xì)胞的激活狀態(tài)。
1、WOLF G2分選后，純度從92 ± 1.9% SD提高至98 ± 0.3% SD（圖2），存活率從88 ± 1.6% SD提高至97 ± 0.1% SD（圖3）。雖然從梯度富集的樣品開始，但WOLF進(jìn)一步去除了死亡的中性粒細(xì)胞，這些中性粒細(xì)胞可以繼續(xù)釋放細(xì)胞因子并增加樣品中活化的中性粒細(xì)胞的數(shù)量[5]。
圖2. 高純度中性粒細(xì)胞的分選結(jié)果: 基于活CD16-AF488陽性細(xì)胞進(jìn)行分選后，中性粒細(xì)胞的純度提高了約6.0%。此外，用Wright染色的（B）全血和（C）分選后樣本的代表性圖像顯示了細(xì)胞碎片和不需要的細(xì)胞的有效去除。使用明場（ECHO Revolve）以40倍放大率對(duì)載玻片進(jìn)行成像。
圖3. 分選后中性粒細(xì)胞活力: 在增加活中性粒細(xì)胞數(shù)量的同時(shí)，重要的是，與SYTOX AADvanced陽性死亡細(xì)胞超過11%的預(yù)分選樣品相比，分選后樣品中的死亡細(xì)胞數(shù)量減少了3倍以上，約為2.9%
2、分選的中性粒細(xì)胞與未分選對(duì)照相比，未觀察到激活中性粒細(xì)胞數(shù)量的變化，而激活對(duì)照組顯示CD11b陽性的激活中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖4）。
圖4. 分選后無中性粒細(xì)胞活化：使用微流控分選可分離出分選后無活化的中性粒細(xì)胞。相比之下，活化對(duì)照樣品與分選前和分選后的樣品相比，活化細(xì)胞增加了兩倍。
WOLF G2單細(xì)胞柔性分選系統(tǒng)為中性粒細(xì)胞的分離和研究提供了一種全新的方法，通過溫和的分選過程，實(shí)現(xiàn)了高純度和高存活率的目標(biāo)，同時(shí)避免了細(xì)胞活化，為后續(xù)應(yīng)用和新療法的發(fā)現(xiàn)提供了有力支持。
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2. Rosales, C. (2018). Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types? Frontiers in Physiology, 9. https://doi.org/10.3389/ fphys.2018.00113
3. Blanter, M., Gouwy, M., & Struyf, S. (2021). Studying Neutrophil Function in vitro: Cell Models and Environmental Factors. Journal of Inflammation Research, Volume 14, 141–162. https://doi.org/10.2147/jir.s284941
4. Blanter M, Cambier S, De Bondt M, Vanbrabant L, P?rtner N, Abouelasrar Salama S, Metzemaekers M, Marques PE, Struyf S, Proost P & Gouwy M (2022) Method Matters: Effect of Purification Technology on Neutrophil Phenotype and Function. Front. Immunol. 13:820058. doi: 10.3389/fimmu.2022.820058
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