小分子誘導(dǎo)的靶蛋白選擇性降解是目前最有前途的新一代藥物發(fā)現(xiàn)方法之一。以 PROTACs（PROteolysis-TArgeting Chimeras）為例，雙功能小分子可以誘導(dǎo)靶蛋白連接到E3連接酶上，隨后形成靶蛋白/PROTAC/連接酶三元復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞靶蛋白通過(guò)蛋白酶體降解（下圖）。

由于PROTAC的二價(jià)性質(zhì)，三元復(fù)合物的形成從根本上說(shuō)是一個(gè)多過(guò)程。PROTAC分子可以首先與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，如果與連接酶的親和力較高，則連接酶結(jié)合后很可能會(huì)啟動(dòng)三元復(fù)合物的形成。如果PROTAC與一種蛋白質(zhì)的結(jié)合因另一種蛋白質(zhì)的存在而增強(qiáng)或減弱，要充分理解平衡，就必須將協(xié)同效應(yīng)在內(nèi)（下圖）。在存在協(xié)同效應(yīng)的情況下，相互作用不再是獨(dú)立的--正協(xié)同是由于與中心分子結(jié)合的其中一種成分促進(jìn)了三元復(fù)合物的形成，而負(fù)協(xié)同則意味著這種結(jié)合抑制了進(jìn)一步的相互作用。

而下圖中所呈現(xiàn)的曲線則展示了基于PROTAC的系統(tǒng)的另一個(gè)特點(diǎn)，三元復(fù)合物平衡呈現(xiàn)鐘形劑量反應(yīng)曲線。在這個(gè)系統(tǒng)中，增加PROTAC的總濃度會(huì)導(dǎo)致三元復(fù)合物濃度降低（也稱為 "鉤子效應(yīng)"），大量過(guò)剩的PROTAC會(huì)使目標(biāo)蛋白和連接酶各自達(dá)到飽和。如果 PROTAC 濃度設(shè)置得過(guò)高，在某些情況下可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不到這些三元復(fù)合物。

預(yù)測(cè)這種臨界濃度和促進(jìn)正協(xié)同效應(yīng)以提高三元復(fù)合物的穩(wěn)定性，被認(rèn)為都是PROTAC誘導(dǎo)的三元復(fù)合物形成的有效方案。

與其他方法相比，質(zhì)量光度法（MP）實(shí)驗(yàn)不需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記或固定，可對(duì)溶液中的真實(shí)分子行為進(jìn)行直接可視化和量化，因此可以對(duì)三元復(fù)合物形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)提供重要數(shù)據(jù)。

我們這次實(shí)驗(yàn)使用了一個(gè)經(jīng)過(guò)充分研究的BRD4（包含兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域BD1和BD2）、VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復(fù)合物和MZ1（PROTAC）系統(tǒng)。BRD4的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)病有關(guān)，基于PROTAC技術(shù)的BRD4降解器已成為一種新型療法。

下圖顯示了質(zhì)量分布隨MZ1濃度增加而變化的情況。BRD4和實(shí)驗(yàn)中使用的 VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復(fù)合物的分子量非常相似：VHL為 41.3 kDa，含有BD1和BD2 結(jié)構(gòu)域的BRD4為 47.5 kDa。據(jù)報(bào)道，MZ1與VHL的親和力為～100 nM，而B(niǎo)D1和BD2的溴化結(jié)構(gòu)域都能與MZ1結(jié)合，對(duì)結(jié)構(gòu)域的測(cè)量結(jié)果分別為 380 nM（BD1）和120 nM（BD2）。BRD4的濃度為 50 nM，而VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復(fù)合物的濃度調(diào)整為100 nM。在實(shí)驗(yàn)中，三元復(fù)合物（所有BRD分子都參與）的完全形成將導(dǎo)致兩個(gè)峰值，一個(gè)在50 kDa（剩余的VHL），一個(gè)在100 kDa（BRD4-MZ1- VHL復(fù)合物），檢測(cè)到的事件數(shù)量大致相同。MZ1 濃度為1200 nM時(shí)，VHL和BRD4達(dá)到飽和狀態(tài)，三元復(fù)合物的濃度驟降。

正如預(yù)期的那樣，在沒(méi)有PROTAC的情況下，檢測(cè)到一個(gè)約50 kDa的單峰，表明BRD4和VHL之間沒(méi)有蛋白-蛋白相互作用（VHL和BRD4之間的質(zhì)量差無(wú)法分辨）。在 20 nM MZ1 時(shí)，就出現(xiàn)了第二個(gè)群體，對(duì)應(yīng)于BRD4-MZ1-VHL復(fù)合物。50 kDa的峰值對(duì)應(yīng)于游離的VHL 和BRD4，以及與PROTAC分子的復(fù)合物，由于質(zhì)量差異較小，這些復(fù)合物無(wú)法分辨。將 MZ1 濃度提高到100 nM會(huì)進(jìn)一步增加BRD4-MZ1-VHL三元復(fù)合物的比例，并導(dǎo)致 BRD4-MZ1?-VHL?二元復(fù)合物的形成。由于VHL的濃度是BRD4的兩倍，因此 50 kDa 處的剩余峰值主要反映了游離連接酶的情況。當(dāng) PROTAC 濃度超過(guò) 1000 nM 時(shí)，觀察到形成的三元復(fù)合物數(shù)量突然下降，這是二元相互作用取代三元復(fù)合物形成的結(jié)果。

綜上所述，質(zhì)量光度法可用于檢測(cè)三元復(fù)合物的形成，并量化中間物種的相對(duì)濃度。重要的是，其結(jié)果是在溶液中獲得的，在溶液中所有成分都存在并可自由相互作用，這與其他方法截然不同，后者只能將 "預(yù)形成 "的二元復(fù)合物與其中一種成分結(jié)合，以評(píng)估協(xié)同效應(yīng)。此外，由于質(zhì)量光度實(shí)驗(yàn)不需要標(biāo)記或固定，并且可以在nM濃度下工作，因此大大節(jié)省了時(shí)間和材料，從而可以對(duì)生理相關(guān)蛋白質(zhì)濃度下的相互作用進(jìn)行詳細(xì)表征。